Microscopia Óptica

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Ham? Gram?

Estudar microorganismos não é uma tarefa nada fácil e se for necessário a observação destes seres, ixiiii… Complica mais ainda! Já pensou na dificuldade de ter que estudar bactérias, seres de tamanhos extremamente reduzidos e que são transparentes ou quase incolores?

Para facilitar o estudo desses bichinhos foram desenvolvidas técnicas diferenciadas. A mais utilizada é a coloração pelo método de Gram.

Mas afinal, que técnica é essa?

O método de Gram é uma técnica de coloração diferencial que, com o auxílio da microscopia ótica, permite distinguir os dois principais grupos de bactérias.

Esta metodologia foi desenvolvida pelo físico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884. Este cientista obteve, através da coloração realizada, uma melhor visualização das bactérias em amostras de material infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as bactérias coravam com este método, o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram morreu em 1935 sem ter conseguido que fosse reconhecida a devida importância ao seu método de coloração.

A coloração de Gram é baseada na composição química e integridade da parede celular bacteriana. Dependendo da cor que adquirirem, as bactérias serão classificadas em Gram-positivas (quando ficam roxas) ou Gram-negativas (quando avermelhadas). Geralmente as Gram-positivas são mais patogênicas.

Atualmente, esta técnica é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo utilizada como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.

Procedimento do método de Gram:

O primeiro passo é o preparo do esfregaço bacteriano que pode ser feito de dois modos: A partir de colônias bacterianas ou a partir de culturas em meio líquido.

A partir de Colônias Bacterianas:

Colocar uma gota de solução salina estéril na lâmina;
Tocar a colônia bacteriana com uma alça de níquel-cromo e homogeneizar o material da alça na gota salina colocada na lâmina;
Distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme” tênue e homogêneo (ESFREGAÇO);
Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente;

A partir de Culturas em meio líquido:

Colocar uma “alçada” da cultura na lâmina;
Distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme” tênue e homogêneo;
Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente;

Antes de iniciar a coloração, assegure-se de que o esfregaço esteja seco. Não fixe o esfregaço em chama, pois este processo promove a desidratação brusca dos constituintes celulares. Lembre-se de que a violeta-de-metila já contém fixador químico.

Depois disso é feito a coloração do esfregaço através do método de Gram. Esse método deve proceder da seguinte forma:

Cubra o esfregaço com violeta-de-metila e deixe por aproximadamente 15 segundos;
Adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta-de-metila e deixe agir por 45 segundos;
Escorra o corante;
Lave em um filete de água corrente;
Cubra a lâmina com lugol diluído (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;
Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;
Adicione álcool etílico (99,5º GL) sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais corante;
Lave em um filete de água corrente;
Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;
Lave em um filete de água corrente;
Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxílio de um papel de filtro limpo;
Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço;
Leia em objetiva de imersão (100 X)

A numeração nos cantos superiores das imagens referem-se aos passos do método acima.

Quais as modificações já ocorreram no método de Gram ao longo dos anos?

O método original utilizava violeta-de-genciana. Hoje se utiliza outro tipo de cristal violeta, a violeta-de-metila. É importante ressaltar que a solução de violeta-de-metila, em sua preparação, já contém fixador químico. Devido a isso, a fixação do esfregaço em chama caiu em desuso e é atualmente contra-indicada.

O diferenciador há 100 anos era uma mistura de solventes. Hoje se usa apenas o álcool etílico (99,5º Gay Lussac). Este é mais seguro do que o álcool acetona utilizado por HURK, que requeria grande habilidade do operador para que não ocorresse a hiperdescoloração. Além do que, não permitia uma boa reprodutibilidade da técnica.

Entretanto, a modificação mais importante foi a do corante secundário, também chamado de corante de fundo. A fucsina fenicada de Gram foi substituída pela safranina. Foi baseado no espectro de cores que substituiu a fucsina pela safranina.

A safranina mantém-se mais distante da violeta no espectro de cor, diferenciado com maior nitidez as bactérias Gram-negativas que se destacam das Gram-positivas e da coloração de fundo, que assume a cor vermelho-claro.

: Representação, no espectro de cores, da distância entre a safranina e a fucsina, em relação à violeta.

Violeta Genciana é um conhecido agente antisséptico e antimicótico, corante primário usado no processo de coloração de Gram; é também usado em hospitais para o tratamento de queimaduras sérias e outras lesões da pele e gengivas.

Como funciona o método da coloração de Gram?

Desde o trabalho original de Hans Gram, vários pesquisadores tentaram, com pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no método de coloração. Conceitos diversos têm sido apresentados, tais como:

A existência de um substrato Gram-positivo e específico;
As bactérias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam diferentes afinidades com o corante primário cristal de violeta;
A existência de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microorganismos Gram-positivos e Gram-negativos.

Este último é o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da parede celular, quanto as dimensões dos espaços intersticiais, por exemplo, “diâmetro do poro”, parecem ser determinantes do resultado final da coloração de Gram.

Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares são cobertas pela violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adição do lugol, também chamado de mordente, ocorre a formação do completo iodo-pararosanilina. Esta reação tem a propriedade de fixar o corante primário nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como álcool etílico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou não perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.

As bactérias que têm a parede celular composta por mureína (peptídeoglicano – peptídeo de ácido n-acetil murâmico), durante o processo de descoloração com álcool etílico, retém o corante. Já as bactérias com parede celular composta predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeos e lipoproteínas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante de fundo.

Os dois grupos de bactérias

Gram-positivas e Gram-negativas

Ambas estão quase iguais no que se refere a número e importância. A diferença básica entre um tipo e outro de bactéria está na sua parede celular.

As Gram-positivas possuem parede celular com uma única e espessa camada de peptidoglicanos. Quando este tipo bacteriano entra em contato com a coloração de Gram adquirem a cor púrpura ou azul quando fixada com cristal violeta. Isto se explica porque estas bactérias retêm o corante presente nestas substâncias.

As Gram-negativas possuem parede celular mais delgada e apresentam uma segunda membrana lipídica, deferente da membrana plasmática. Quando em contato com a coloração Gram o lipídio da membrana mais externa é dissolvido no álcool e libera o primeiro corante, o cristal violeta. Ao fim do processo essas bactérias estão na cor rosa-avermelhada do segundo corante, a safranina.

As diferentes reações virulentas

Um P.S.: Para quem não sabe, virulência é a capacidade patogênica de um microorganismo, ou seja, a capacidade deste em transmitir doenças infecciosas, medida através da taxa de mortalidade que ele produz e/ou por seu poder de invadir tecidos do hospedeiro.

As bactérias gram-positivas e gram-negativas possuem formas diferentes de ataque virulento. As gram-negativas possuem característica patológica, devido a substancia LPS.

As gram-positivas possuem a característica de aderência, devido à exotoxina, composta pelo ácido lipoteinóico.

No envelope celular das bactérias gram-negativas encontramos quimicamente de 20 a 25% de fosfolipídios e 45 a 50% de proteínas, sendo os 30% restantes de uma lipoproteína, o lipopolissacarídeo.

Abaixo, imagens de microscopias ópticas de bactérias em variadas formas.